Особливим політичним організмом, який підпорядковувався українському гетьману, було Запорожжя. В 1686р., за російсько-польською угодою Запорозька Січ перейшла з-під подвійного підпорядкування Варшаві та Москві під виключну зверхність останньої. І якщо попередній невизначений статус був козакам на руку, дозволяючи їм лавірувати між двома державами, то відтепер несанкціонована співпраця з Річчю Посполитою ставала незаконною. З цього часу Запорожжя за тодішнім формулюванням знаходилося під царською владою та гетьманським регіментом. Не могло Низове Військо контактувати й з південними сусідами через початок російсько-турецької війни. Однак право на самостійні політичні зв’язки з іноземними державами було цілком природним у розумінні запорожців. Так, у одному з листів до гетьмана Івана Самойловича від 1686р. вони, обвинувачуючи гетьмана в намірах «викорінити» Низове Військо, вимагали поваги до себе, зазначаючи, що «не тільки пресвітлі государі, царі наші православні, але й найясніші християнські монархи, римський цісар і король польський, також цар, і вейзир турецький, та хан кримський, пишучи до нас при належних потребах, віддають нам належну шану і не понижують лицарської хвали нашої».
Зрозуміло, що й наступнику цього гетьмана довелося вирішувати не питання взаємин з Січчю, яка традиційно була осередком початку небезпечних для соціальної стабільності рухів, на яку насамперед звертали увагу зовнішні сили, плануючи певні антиукраїнські чи антиросійські акції. Питанням великої ваги було те, наскільки Мазепа зможе впливати на Січ, наскільки, врешті, вдасться йому на шляху до підпорядкування Запорожжя гетьманській владі, що не могло відбутися відразу, а переросло в тривалий та наповнений конфліктами процес.
Гетьману довелося прикласти чимало зусиль для боротьби з такими діями Січі, які суперечили політиці Батурина. А приводів до цього було досить. Насамперед слід згадати постійну практику налагодження мирних взаємин запорожців з татарами й турками під час війни, а саме тоді, коли припинялися значні воєнні акції, котрі проводилися за участю російських та українських гетьманських сил. На такі дії козаків штовхали економічні інтереси і аргументи щодо необхідності дотримуватися спільної політичної лінії на них не діяли. В листопаді 1689р. вони відправили посольство до польського короля з клопотанням про підданство. Надалі низові козаки продовжували практику служби за винагороду Речі Посполитій. А на початку XVIII ст. запорожці вчинили цілу низку дій, які викликали різко негативну реакцію як у Батурині, так і в Москві. Так, були розгромлені селітряні майдани на Самарі, які належали власникам з Гетьманщини, звучали погрози знищення російських фортець на Запорожжі, значний міжнародний резонанс викликало пограбування підданих Порті грецьких купців, які наважилися їхати зі своїми товарами через запорозьку територію. В 1703р. запорожці відмовилися присягати на вірність Петру І, через існування на їхній території російських фортець. З 1702 по 1705 рр. нагальною була проблема розмежування на місцевості володінь між Турецькою та Російською державами, чому чинили перешкоди як запорожці, так і татари. В 1707—1708 рр. певна кількість запорожців взяла участь у повстанні на чолі з Кіндратом Булавіним.
Але чи найбільша криза виникла наприкінці 1702 — на початку 1703 рр., коли запорожці готували спільний виступ з татарами проти Росії, що мало призвести до початку нової війни з Османською імперією. Гетьман готувався до збройного протистояння, допускалася й можливість переходу запорожців під владу турецького султана. Згадаймо, що все це відбувалося тоді, коли за антиурядові дії в самій Росії цар не зупинявся перед масовими стратами. На той час дії запорожців настільки дратували Мазепу, що й він ладен був висловлюватися про самі радикальні кроки. Так, в 1703р. в листі до боярина Федора Головіна гетьман запропонував знищити Січ — «прокляте гніздо запорожців».
